 |
20-01-2010, 23:00
|
 |
|
|
חבר מתאריך: 12.05.06
הודעות: 13,563
|
|
|
כתבה שתתפרסם בקרוב בבטאון הפקולטה שלי
ותסקור בקצרה את עבודת המחקר שלי עד כה:
טביעת אצבע מאקרומולקולרית של מיקרואורגניזמים בסול-ג'ל: שיטה לזיהוי חיידקים בנוזל
מאת: טלי כהן
טלי כהן הנה דוקטורנטית ביחידה להנדסת הסביבה מים וחקלאות ומחקרה מתבצע בהנחיית פרופ"ח
רוברט ארמון. את התואר הראשון במדעי החיים השלימה באוניברסיטה העברית, ואת התואר השני
בביוכימיה, שעסק בנושא מטבוליזםשל ברזל בתאי מערכת החיסון בהנחיית פרופ' יואב קבנצ'יק,
השלימה באוניברסיטההעברית.
השיטות הנכחיות לזיהוי מיקרואורגניזמים כוללות תרביות או שיטות מולקולריות – שיטות בהן הזמן
הנדרש לקבלת תוצאות הוא ארוך יחסית. בעבודה זו אנו מציעים שיטה בה הזיהוי הוא מהיר בהרבה.
היישומים לשיטה יכולים להיות רבים ומגוונים, החל בזיהוי מיקרואורגניזמים בדוגמאות מים, שפכים
וקולחין, וכלה ביישומים קליניים לבדיקת נוכחות חיידקים בנוזלי גוף ובבדיקות וטרינריות.
מטרת מחקרנו היא שימוש בשיטה של טביעת אצבע מולקולרית לזיהוי מהיר של מיקרואורגניזמים
בנוזל, כולל חידקים פתוגניים (גורמי מחלות), במהירות ובדיוק מירבי.
סול-ג'ל היא שיטה המשמשת ליצירת פולימרים קרמיים בטמפרטורת החדר, ובכך מאפשרת פעילות
גומלין עם מולקולות ביולוגיות. סול-ג'ל גם קרוי בשפה עממית "זכוכית בטמפרטורת החדר" .פילמור
יחידות סילוקסניות מתרחש תוך תגובות הידרוליזה ודחיסה בין מונומרים של היברידים של סיליקה
ושאר אורגני, ליצירת מטריצה תלת מימדית בעלת תכונות נקבוביות ושקיפות.
הטבעה מולקולרית (molecular imprinting) בפולימרים משמשת ביישומים כגון חיישנים, ומהווה כר
פורה למחקר עבור הטמעה בתעשייה. כיום הטבעה מולקולרית משמשת ליצירת חיישנים בעלי רגישות
גבוהה.
טכניקת הטבעה מולקולארית הומצאה ופותחה ע"י Mosbach בשנות ה-90' על בסיס של יצירת רשת
פולימרית מיוצרת ומיוצבת סביב למולקולה המהווה תבנית (template). מבחינה מאקרוסקופית הרעיון
דומה ליצירת יציקה מסביב לגוף כלשהו כמו בתעשיות הפלדה או תעשיות אחרות. לאחר הסרת התבנית
(באמצעים כימיים פשוטים), נותר מבנה חלול בפולימר בעל גודל, צורה ו/או תכונות כימיות ייחודיות
לתבנית. חללים אלה מציגים זיקה למולקולות זהות לאותה תבנית, אך לא למולקולות בעלות מבנה
שונה, (דומים אך לא זהים)(ציור מס' 1). ייצור שכבות דקות בשיטה זו, משמש כיום ליישומים בחיישנים
בתחומי הכימיה והביולוגיה. זמן התגובה הנמוך, כתוצאה מקיצור מרחק הדיפוזיה בין הנוזל לחיישן
מהווה יתרון בולט.
ציור מס. 1 תאור סכמטי של תהליך הטבעת חידקים בשכבות דקות של סול-ג'ל
בעבודה זו נעשה שימוש באורמוסיל מסוג TEOS (כחומר מקדים) להטבעת תאים שלמים של מגוון
מיקרואורגניזמים, עם תכונות שטח פנים ומורפולוגיה שונות, כמו: Deinococcus radiodurans, E.
coli, Bacillus subtilis, Sphaerotilus natans and Cryptosporidium parvum. מיקרואורגניזמים
אלו עורבבו בנפרד עם החומר המקדים בעודו נוזל, ולאחר תהליך הג'לציה יובש כשכבה דקה על
זכוכיות נושא והוסרו בעזרת צביעת גרם. כפי שניתן לראות בציור מס' 2 ( (Aהסרת החיידקים הכלואים
מהפולימר הייתה מלאה עם יצירת תבניות חלולות זהות לחידקים שהוטבעו.
לאחר חשיפת השכבות המוטבעות לתרחיף חדש של חיידקים זהים, השכבה המוטבעת הראתה זיקה
וספציפיות לחיידק, ולא נצפתה ספיחה לא ספציפית של חיידקים אחרים (ציור מס' 2-B). בכל השכבות
המוטבעות, ניתן היה להבחין במורפולוגיה של המיקרואורגניזם המוטבע. במיוחד ניתן לראות זאת
בציור מס' 3 ((B, בו ניתן לראות עקבה של אואוציסט (oocist) קריפטוספורידיום, הצבועה ע"י נוגדן
ספציפי למעטפת החיצונית של האואוציסט קשור ל-FITC. צביעה זו מצביעה על חומר מהמעטפת
החיצונית, שנשאר בתוך העקבה.
ציור מס' 2: צילומי SEM של פילמים מוטבעים עם S. natans (A) לפני ספיחה חוזרת של החיידקים.
(B) אחרי ספיחה של חיידקים מתמיסה.
ציור מס' 3: (A) תמונות של סול-ג'ל מוטבע ע"י אואוציסטות של Cryptosporidium parvum כפי שנראו
ב-SEM ו במיקרוסקופ קונפוקאלי. (B) פילמים מוטבעים לאחר חשיפה של 30 דקות לתרחיף
אואוציסטות עם האואוציסטות הספוחות לעקבות.
חשיפה של השכבות המוטבעות לתרחיף של אותו מיקרואורגניזם הראתה ספיחה ספציפית של
מיקרואורגניזמים מרחפים על העקבות המוטבעים בחומר הקראמי, ללא ספיחה לא ספציפית באזורים
לא מוטבעים.
עפ"י תוצאות ראשוניות, הונח כי הספיחה הספציפית התקבלה הודות לחומר אורגני שאריתי הנותר
בעקבות הוצאת התבנית, שמקורו במעטפת החיצונית של המיקרואורגניזמים. על מנת לאשר הנחה זו,
בוצע נסיון להפקת חלבון מפילמים מוטבעים והרצתו בג'ל אלקטרופורזה. כפי שניתן לראות בציור מס' 4,
התקבלו פסים בעמודת הפולימר המוטבע לעומת אפס פסים בעמודת הפולימר הלא מוטבע.
ציור מס' 4. הרצת חלבונים ב- SDS-PAGE וצביעת הג'ל עם ניטראט הכסף . בעמודה הראשונה
(משמאל) – סמני גודל סטנדרטיים. בעמודה השלישית – פילמים מוטבעים עם D. radiodurans,
בעמודה רביעית –תמס (lysate) של חיידקי D. radioduransובעמודה החמישית - שכבות לא
מוטבעות.
להערכת רגישות השיטה, נעשו מיהולים עשרוניים של Deinococcus radiodurans ו- E. coli.
השכבות המוטבעות נחשפו לריכוזים שונים של חיידקים למשך 30 דקות, והחיידקים הספוחים נספרו
תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניסוי זה הראה שהשיטה רגישה עד לריכוז של 103 חיידקים במ"ל, כפי
שניתן לראות בציור 5.
ציור מס' 5: רגישות של שכבות מוטבעות בשני נפחי בדיקה שונים (100 ו-5 מ"ל).
על מנת לבדוק את סלקטיביות השיטה, בוצעו שני סוגי ניסיונות:. בראשון, שכבות מוטבעות עם
Deinococcus radiodurans נחשפו למשך 30 דקות לתערובת של D. radiodurans, E. coli ו-B.
subtilis. החיידקים היחידים שנצפו היו מסוג D. radiodurans. מטרת הניסוי השני הייתה לבסס את
הסלקטיביות, והפעם בין שני חיידקים דומים בצורתם החיצונית – שניהם בעלי מבנה של מתג. לצורך
זה השכבות הוטבעו ע"י E. coli, ונחשפו לתערובת של E. coli ו- S. natans, שנצבעו קודם לכן ע"י
שני צבענים פלואורוסצנטיים שונים. תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי היכול להפריד בין שני הצבעים בהתאם
לאורך הגל, רק חיידקי E. coli נראו ספוחים לפולימר המוטבע. הספציפיות לחיידק נובעת ככל הנראה
מהתאמה מורפולוגית של החיידק לעקבה, וכן גם מהכרה של שאריות החומר האורגני בעקבות
המוטבעים בפולימר.
לסיכום, אנו מציגים כאן שיטה חדישה המשתמשת בטביעת אצבע של מולקולות פני שטח לזיהוי
מיקרואורגניזמים באופן ספציפי. המיקרואורגניזם המוטבע משאיר אחריו חלקים מהמעטפת החיצונית,
ותחת תנאים אלו – אנו רואים ספציפיות בספיחה, שגבוהה בכמה סדרי גודל לעומת פולימרים לא
מוטבעים. אנו תקווה כי שיטה זו תוכל לשמש לזיהוי מגוון מיקרואורגניזמים בצורה ישירה בנוזלים
שונים.
|
|
ראשי
צ'אט
מצב כלאיים
